Cytométrie de masse (CyTOF)

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La cytométrie de masse utilise plusieurs des mêmes principes que la cytométrie de flux. Cependant, à la place d'anticorps couplés à des fluorochromes, les anticorps utilisés pour cette technique sont couplés à des isotopes de métaux rares. Les cellules marquées avec ces anticorps sont nébulisées en gouttelettes qui sont introduites dans un spectromètre de masse couplé à un plasma inductif (ICP-MS) où chaque cellule est vaporisée dans un plasma d'argon à >7000 °C.  Le nuage d'ions d'une cellule individuelle est ensuite soumis à une analyse élémentaire par temps de vol (TOF), les concentrations associées à la cellule pour chaque métal unique étant intégrées dans un fichier FCS (Figure 1).

Figure 1: Diagramme de flux pour l'analyse des cellules par cytomètre de masse CyTOF (adapté de Current Opinion in Immunology)

Les avantages principaux de la cytométrie de masse sont :

1. La disponibilité d'un grand nombre d'isotopes métalliques qui peuvent être utilisés pour marquer différents anticorps ciblant divers marqueurs liés aux cellules immunitaires
2. Absence de chevauchement de masse entre les isotopes élémentaires, de sorte que des compensations ne sont pas nécessaires comme dans la cytométrie de flux
3. Faible signal de fond puisque les isotopes métalliques utilisés ne sont pas détectables dans les échantillons biologiques
4. Contrairement aux fluorophores qui peuvent avoir des intensités de signal très différentes, l'instrument CyTOF a une sensibilité élevée et similaire pour tous les isotopes métalliques analysés
5. Convient au multiplexage de plus de 20 échantillons cellulaires différents qui peuvent être colorés et analysés en parallèle avec le même panel d'anticorps

Ces caractéristiques permettent de mesurer plus de 50 paramètres simultanément sans qu'il soit nécessaire de compenser entre les différents anticorps à couplage métallique. Le marquage des cellules avec ces anticorps CyTOF montre d'excellentes corrélations dans les études de validation croisée réalisées avec des anticorps marqués par fluorescence et analysés par cytométrie en flux (Figure 2).

Figure 2 : La validation croisée des anticorps marqués aux isotopes métalliques utilisés en cytométrie de masse montre une excellente corrélation avec les anticorps comparables marqués par fluorescence dans l'analyse par cytométrie de flux.

L'analyse des échantillons de sang par cytométrie de masse permet une caractérisation phénotypique simultanée de presque toutes les populations de cellules immunitaires. Le laboratoire de diagnostic utilise ces profils pour identifier les anomalies dans les populations de cellules immunitaires d'un patient par rapport aux normes d'individus sains. Ces analyses peuvent être réalisées par des approches de gating standard et également à l'aide de logiciels d'analyse non supervisée tels que t-SNE qui sépare automatiquement les cellules en populations sur la base de leurs caractéristiques phénotypiques (Figure 3). En plus de la caractérisation phénotypique, les panels de cytométrie de masse sont utilisés pour évaluer l'activité fonctionnelle des populations de cellules immunitaires adaptatives et innées en mesurant les niveaux intracellulaires de différentes cytokines ou protéines cytotoxiques (Figure 4A).  De la même manière, la cytométrie de masse peut également être utilisée pour évaluer les événements de signalisation liés à l'immunité en surveillant les niveaux de phosphorylation de jusqu'à onze protéines de signalisation différentes (Figure 4B).

Figure 3 : Les données de cytométrie de masse peuvent être analysées selon une approche manuelle pour appliquer des gates ou en utilisant un logiciel d'analyse non supervisée tel que t-SNE qui peut séparer toutes les principales populations de cellules immunitaires en fonction de leur profil d'expression phénotypique.